Elisa試劑盒實驗常見問題分析

Elisa試劑盒實驗常見問題分析

　　1、ELISA試劑盒試驗出現非常弱的結果，常見有7種原因，其解決方法如下：

　　1)可能原因：溫育的時間或者溫度不夠；

　　解決方法：校正溫育箱溫度。

　　2)可能原因：顯色反應時間太短；

　　解決方法：校正定時鐘準確定時。

　　3)可能原因：所用配制緩沖液的蒸餾水有問題；

　　解決方法：使用新鮮合格的蒸餾水。

　　4)可能原因：加入/酶的稀釋液濃度太低；

　　解決方法：按照說明書保存試劑盒和準確配制工作液。校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密。

　　5)可能原因：酶標儀濾光片不正確；

　　解決方法：檢查酶標儀使用的濾光片。

　　6)可能原因：試劑盒沒有充分平衡；

　　解決方法：試劑室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫。

　　7)可能原因：不正確的試劑儲存方式；

　　解決方法：按照說明書要求保存試劑盒。

　2、ELisa試劑盒試驗的標準曲線和測定的重復性差，這是什么原因造成的？

　　答：試驗的標準曲線和測定的重復性差，這是典型的由測定操作引起的問題，常見原因如下：

　　a)可能原因：加樣本及試劑量不準；孔間不一致；

　　解決方法：校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密。

　　重復某一樣品時，加樣時間盡可能與次接近；

　　重復測定標本，操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；

　　樣品稀釋前應充分混勻。

　　b)可能原因：加樣過快，孔間發生污染；

　　解決方法：重復測定標本，操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；加樣不要過快。

　　c)可能原因：加錯樣本；

　　解決方法：檢查記錄和試劑，是否加錯樣本。

　　d)可能原因：加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區；

　　解決方法：加樣槍頭不要貼壁。

　　e)可能原因：不同批號試劑盒中組分混用；

　　解決方法：不同批號試劑盒中組分不可混用。

　　f)可能原因：溫育時間、洗板、顯色時間不一致；

　　解決方法：檢查時間是否一致。

　　g)可能原因：孔內污染雜物；

　　解決方法：離心樣品，排除雜物。

　　h)可能原因：試劑/樣品沒有混勻；

　　解決方法：充分混勻樣品和試劑。

　　i)可能原因：血清標本未*凝固即加入，反應孔內出現纖維蛋白凝固或殘留血

　　細胞，易出現假陽性反應等。

　　解決方法：待血清標本*凝固后做試驗。

　　3、 試驗結果白板，而且陽性對照不顯色，應如何分析和查找原因？

　　答：試驗結果白板，而且陽性對照不顯色，常見原因如下：

　　a)可能原因：漏加或者誤加試劑；

　　解決方法：檢查試驗記錄和剩余試劑。每次加液前均應核對標簽。

　　b)可能原因：試劑過期；

　　解決方法：使用有效期內的產品。

　　c)可能原因：洗板液配制中出現問題，如量筒不干凈含HRP酶抑制物（疊氮鈉

　　等）；

　　解決方法：使用干凈的器皿，正確配制試劑。

　　d)可能原因：溫育的時間或溫度不夠；

　　解決方法：校正溫育箱溫度。

　　e)可能原因：標準品失活或者丟失；

　　解決方法：標準品正確保存、溶解和混勻。

　　f)可能原因：失活或者丟失；

　　解決方法：更換或者提高濃度

　　g)可能原因：酶失活或者丟失

　　檢查方法：把工作濃度的酶再稀釋20－100倍，取5uL加入50ul的顯色底物，終止后顯色是否能達到1.0左右，此為酶的粗略估計。

　　解決方法：更換酶或者提高酶的濃度。

　　h)可能原因：顯色底物失活

　　檢查方法：加少量的工作濃度的酶，TMB是否很快顯色。

　　解決辦法：更換顯色底物.

4. Elisa試劑盒試驗結果空白背景高，這是什么原因造成的？

　　答：試驗結果空白背景高，常見原因如下：

　　a)可能原因：洗板不干凈；

　　解決方法：充分洗滌，*拍干；洗板要防止交叉污染；濃縮洗液準確配制；吸嘴盡可能一次性使用；加樣或加酶拍板的濾紙應棄去不用，不要反復使用，否則易造成污染。

　　b)可能原因：顯色液變質或者試劑過期；

　　解決方法：檢查試劑盒有效期。

　　c)可能原因：試劑稀釋有誤，如加酶的濃度過高；

　　解決方法：請按說明書所示稀釋倍數配制；

　　d)可能原因：蒸餾水受酶等污染；

　　解決方法：使用新鮮蒸餾水；

　　e)可能原因：試劑混用；

　　解決方法：不同批號試劑勿混用。

　　f)可能原因：培養箱溫度超過37℃或反應時間過長。

　　解決方法：顯色反應時間適當縮短。